در بررسی اخیر منتشر شده در مجله PNASمحققان روش‌های تحویل پروتئین‌های مرتبط با پروتئین‌های مرتبط با CRISPR (Cas) را به‌صورت خوشه‌ای غیر ویروسی و اختصاصی سلولی به‌طور منظم با فاصله‌ی منظم با یکدیگر بررسی می‌کنند و بر مزایای آن‌ها برای تحقیقات و کاربردهای ژن‌درمانی تأکید می‌کنند.

مطالعه: تحویل غیر ویروسی هدفمند ویرایشگرهای ژنوم در داخل بدن. اعتبار تصویر: Catalin Rusnac / Shutterstock.com

بهبود انتقال آنزیم های CRISPR-Cas

آنزیم های CRISPR-Cas دقت و سهولت در ویرایش ژنوم را ارائه می دهند. با این حال، آنها همچنین با نگرانی های ایمنی خاصی برای پتانسیل آنها برای ایجاد تغییرات دائمی همراه هستند. ویژگی پیشرفته Cas9 نشان دهنده پیشرفت است، اما تحویل هدفمند برای به حداقل رساندن خطرات حیاتی است.

ناقل های ویروسی به طور گسترده ای به عنوان وسایل انتقال این آنزیم ها مورد مطالعه قرار گرفته اند. با این وجود، این سیستم ها همچنین با خطرات ایمنی زایی و اختلالات ژنتیکی همراه هستند.

جایگزین‌های نوظهور مانند ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR-Cas (RNPs) و نوکلئازهای رمزگذاری شده با اسید ریبونوکلئیک پیام‌رسان (mRNA) اثرات خارج از هدف و خطرات انکوژن را کاهش می‌دهند، اما فاقد هدف‌گیری خاص هستند. به عنوان مثال، Cas9 RNP ها، که حضور سلولی گذرا و مقرون به صرفه بودن را ارائه می دهند، اثرات خارج از هدف و ایمنی زایی را کاهش می دهند. با این حال، تحویل هدفمند آنها یک چالش مهم است. بنابراین، نیاز فوری به استراتژی های تحویل پیشرفته وجود دارد.

تحقیقات بیشتر برای توسعه مکانیسم‌های تحویل ایمن‌تر و دقیق‌تر برای سیستم‌های CRISPR-Cas، که ویرایش هدفمند ژنوم را با حداقل اثرات خارج از هدف و خطرات بالینی کمتر تضمین می‌کند، حیاتی است.

Ex vivo روش های تحویل هدفمند

تحویل هدفمند را می توان از طریق جداسازی فیزیکی سلول ها برای ex vivo ویرایش ژنوم این روش به ویژه در مورد سلول های خونساز مؤثر است که به راحتی می توان آنها را در خارج از بدن جدا و ویرایش کرد.

تکنیک‌هایی مانند الکتروپوریشن ویرایش کارآمد ژنوم را در سلول‌های T و همچنین سلول‌های بنیادی و پیش‌ساز خونساز (HSPCs) تسهیل کرده‌اند و در نتیجه پتانسیل منحصربه‌فردی را برای تحول در درمان بیماری‌های هماتولوژیک مانند بیماری سلول داسی شکل (SCD) و بتا تالاسمی ارائه می‌کنند. علیرغم اثربخشی آن، یک محدودیت مهم الکتروپوریشن، کاربرد محدود آن برای سایر بافت ها و همچنین اثرات سیتوتوکسیک بالقوه است.

Ex vivo ویرایش ژنوم نیز پزشکی بازساختی را پیشرفته کرده است. به عنوان مثال، سلول های بنیادی پرتوان القایی (iPSCs) ویرایش شده با Cas9 RNP برای توسعه درمان اختلالات ژنتیکی پوست و دیابت نوع 1 (T1D) استفاده شده است، بنابراین پتانسیل این روش برای جایگزینی یا بازسازی بافت های آسیب دیده را نشان می دهد. این ویژگی حداقل خطر ویرایش انواع سلول های ناخواسته را تضمین می کند و یک محیط کنترل شده برای مداخلات درمانی فراهم می کند.

در داخل بدن ویرایش ژنوم: چالش ها و فرصت ها

در داخل بدن ویرایش ژنوم در توانایی خود برای هدف‌گیری دقیق بافت‌های خاص بدون استفاده از جداسازی محدود است. تکنیک‌هایی مانند تزریق مستقیم به موفقیت موضعی در مغز، پوست و تومورها دست یافته‌اند، در حالی که نوآوری‌هایی مانند پپتیدهای نافذ به سلول و نانوذرات لیپیدی (LNPs) امکان انتقال گسترده‌تری را ارائه می‌دهند. این پیشرفت‌ها ناگزیر از توسعه سیستم‌های CRISPR-Cas در آینده پشتیبانی می‌کنند که می‌توانند به صورت سیستمی با دقت خاص سلول ارائه شوند.

پیشرفت‌ها در تحویل: LNP و وسایل نقلیه تحویل بسته (EDV)

LNP ها تحویل سیستمیک و فرار اندوزومی را برای آزاد کردن ابزارهای ویرایش ژنوم مستقیماً در سلول ها امکان پذیر می کنند. با بسته‌بندی توالی‌های ژنتیکی بزرگ‌تر و هدف قرار دادن بافت‌های خاص، LNP‌ها قبلاً برای پتانسیل آن‌ها برای درمان بیماری‌های پیچیده‌ای مانند هیپرکلسترولمی خانوادگی مورد بررسی قرار گرفته‌اند.

وسایل نقلیه الهام گرفته شده از بیولوژیکی شامل ذرات ویروس مانند (VLP) و وزیکول های خارج سلولی (EVs) مکانیسم های انتقال ویروس را برای ویرایش هدفمند تقلید می کنند. این EDV ها از فرآیندهای طبیعی برای ویرایش کارآمد ژنوم استفاده می کنند، در نتیجه چشم انداز در حال تکامل روش های تحویل CRISPR-Cas و پتانسیل آنها برای غلبه بر محدودیت های فعلی را نشان می دهند.

Ex vivo دقت با VLP ها

VLP ها در ارائه دقیق ابزارهای ویرایش ژنوم به انواع سلول های خاص در یک نوید نشان داده اند ex vivo تنظیمات. این ذرات مهندسی شده اغلب از گلیکوپروتئین VSV-G به دلیل طیف گسترده گیرنده آن، از جمله گیرنده لیپوپروتئین با چگالی کم (LDL-R) برای تسهیل ورود به طیف گسترده ای از سلول های انسانی، مانند سلول های T، سلول های B استفاده می کنند. ، iPSCها و خوشه تمایز (CD) 34+ HSPC.

این کاربرد گسترده با شبه‌تایپ کردن VLPها با سایر گلیکوپروتئین‌های ویروسی برای هدف قرار دادن سلول‌ها در نهایت بر اساس برهمکنش‌های گیرنده خاص، اصلاح می‌شود. به عنوان مثال، استفاده از گلیکوپروتئین پوششی ویروس نقص ایمنی انسانی نوع 1 (HIV-1) VLP ها را به سلول های T CD4+ هدف قرار می دهد، در نتیجه ویژگی تحویل را افزایش می دهد و اثرات خارج از هدف را به حداقل می رساند. این رویکرد در برنامه‌ریزی مجدد سلول‌های ایمنی برای درمان سرطان و ویرایش سلول‌های بنیادی برای پزشکی احیاکننده مؤثر بوده است.

در داخل بدن با EDV ها پیشرفت می کند

هر دو VLP و EV پلتفرمی برای تحویل مستقیم و محلی ویرایشگرهای CRISPR-Cas9 ارائه می دهند. این EDV ها وقتی مستقیماً در محل مورد نظر، مانند چشم یا بافت عضلانی تجویز می شوند، نیاز به هدف گیری خاص سلول را دور می زنند، بنابراین فرصتی برای درمان بیماری هایی مانند دیستروفی عضلانی دوشن (DMD) و بیماری های تخریب کننده عصبی فراهم می کنند. علاوه بر این، تجویز سیستمیک VLPs به ویرایش هدفمند کبد برای درمان اختلالات مرتبط با کبد دست یافته است.

ویژگی این سیستم ها با نمایش مولکول های هدف بر روی سطح VLP افزایش می یابد، که دستگاه ویرایش ژنوم را به سلول ها یا اندام های خاص با حداقل فعالیت خارج از هدف هدایت می کند.

دستورالعمل های آینده

پتانسیل کامل درمان‌های CRISPR-Cas، به‌ویژه برای بیماری‌های غیر کبدی و غیر هماتولوژیک، بر توسعه وسایل حمل و نقل پیچیده‌تر متکی است. چالش در دستیابی به ویژگی نوع سلولی نهفته است زنده بدون ایجاد پاسخ های ایمنی یا اثرات خارج از هدف.

نوآوری های اخیر در فرمولاسیون LNP و اکتشاف EDV های الهام گرفته از بیولوژیک، استراتژی های امیدوارکننده ای را برای تسهیل دقت تحویل ارائه می دهد. این پیشرفت‌ها، همراه با غربالگری با توان عملیاتی بالا و مهندسی آنتی‌بادی، احتمالاً منجر به توسعه درمان‌های کم تهاجمی و بسیار خاص CRISPR-Cas خواهد شد.